李慧林潜规则 李慧林:解开生命基本法则的“环”之谜

生物通报道:中心法则是遗传信息从DNA到DNA的复制、继而从DNA传递给RNA的转录、再从RNA传递给蛋白质的翻译过程的转移法则,是生物大分子DNA、RNA和蛋白质参与细胞生命活动所遵循的重要规律。其中DNA复制就是这一法则的第一步,也是最重要的一步,虽然多年来科学家们解析了这一步骤的多个方面,但是关于复制起始复合体(ORC)的环状蛋白质依然是个谜。

来自美国文安德尔研究所等处的研究人员最近详细描述了DNA复制中的这个关键第一步,相关研究成果公布在2月13日的Nature Structural & Molecular Biology杂志上,文章的通讯作者之一,文安德尔研究所的表观遗传学中心教授李慧林(Huilin Li,音译)博士说,“这是关于一个‘王者’环的故事。

生物学家多年前就已经知道,ORC和解旋酶是DNA复制起始和复制进程中必不可少的环状结构,但到目前为止,我们从未了解ORC环如何将解旋酶环装载到DNA上的。”

多细胞生物在细胞分裂之时进行生长,在细胞分裂之前,它必须为新细胞生成组成元件副本。由于DNA信息被密封在DNA双链内部,访问和复制信息之前一种叫做复制体(replisome)的专门机器必须要解开DNA链。

MCM马达是复制体的关键组成部分,它负责解开配对的DNA链。而MCM是一个闭合的蛋白质环,在它环绕DNA长链之前必须首先要打开它,ORC就负责解决这一问题。它可以打开MCM环,让其能够环绕并解开DNA。

这项最新研究揭示了ORC的特殊α-螺旋能进入DNA的一个凹槽中,启动DNA复制的一系列级联微管相互作用。此外研究还发现ORC在Cdc6和Cdt1的帮助下,通过翼状螺旋结构域的配对相互作用将解旋酶核心部分加载到DNA上,这样就会形成14个组合蛋白结构,完成第一个解旋酶环的加载,然后准备加载下一个环。

这整个过程代表了一个非常复杂且精细的系统开始运作,在人体许多细胞中DNA上的数万个位点上不间断工作,它们都是从ORC开始的。

此前的研究表明,ORC是一个六亚基蛋白质复合体,其中有五个亚基形成了一个微微张开的环,第六个亚基Orc6形成了一条尾巴。最新研究显示,亚基组成的复合物形成月牙状,包裹住DNA双链。然后ORC会召集第七种蛋白,也就是Cdc6,绕住DNA。这个环与第二个环相连,微染色体维持蛋白(Cdt1-bound Mcm2-7 hexamer)围绕在DNA周围,完成第一个Mcm2-7六聚体的加载。

“这就像是把一条珍珠串在一根绳子上,不过DNA链更长,因此珍珠不会到达末端。相反它们会沿着链以某种方式打开,之后再次关闭,”文章的另外一位通讯作者,伦敦帝国理工学院教授Christian Speck说。

这项研究是通过冷冻电子显微镜(cryo-EM)完成,李教授表示,“我们希望通过描绘这一过程,能最终将这种知识转化为DNA复制相关的治疗方法,用于包括癌症和罕见病在内的多种疾病的治疗”。

生物通:复制起始复合体(ORC)是DNA复制的关键元件,这项研究主要是采用了什么方法剖析了ORC环状结构的一系列组装过程呢?

李教授:我们采用了cryo-EM方法分析了酿酒酵母OCCM(ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7)复合物的结构,这个复合物是由ORC-Cdc6通过Cdt1结合的Mcm2-7六聚体捕获结合而形成的。我们利用体外反应方法获得了复合物:在带有复制起始质粒DNA的试管中将纯化组分如ORC,Cdc6,Cdt1和解旋核心复合物Mcm2-7混合在一起。

DNA会连接到磁珠上,然后利用磁性将反应产物——OCCM复合物与反应物分离。

这是一项合作成果,我们文安德尔研究所的实验室完成了冷冻电子显微的结构测定,而样本是由伦敦帝国学院的Christian Speck博士实验室准备的。参与这项工作的还包括冷泉港实验室的Bruce Stillman博士实验室,他们完成了一些生物化学研究,另外交联质谱的工作则由爱丁堡大学的Juri Rappsilber博士实验室完成。

生物通:最新研究发现了ORC、Cdc6等组成的14个蛋白组合体结构,这一结构的特点是什么?相比于之前发现的结构具有哪些相同之处和不同之处呢?

李教授:这项工作最重要的发现是揭示了Mcm2-7如何通过ORC-Cdc6加载到原始DNA上的。整个装载过程是由装载机(ORC-Cdc6)和Mcm2-7中都发现的所谓翼型螺旋结构域(WHD)介导的。ORC-Cdc6中的几个WHD结构在装载过程中是与Mcm2-7的WHD相互锁定的。

我们还以近原子的分辨率获得了与起始DNA结合的ORC-Cdc6的结构,这是OCCM结构的一部分。一直以来科学家们都知道酵母ORC具有识别复制起点某些特殊序列的能力,但ORC如何做到这一点依然是个谜。我们的结构揭示出ORC的一个亚基Orc4具有特殊的插入α-螺旋,这种螺旋可以滑入DNA双链的主槽中,从而令ORC原始序列具有识别能力。

在ORC-Cdc6召集Mcm2-7的时候,它处于激活状态。另外一个实验室曾于Nature发表了fly ORC(2015)的晶体结构,那个结构处于非激活状态,因为fly ORC既不能与结合DNA兼容,也不能与负载因子Cdc6兼容。

最近,冷泉港实验室的Leemor Joshua-Tor实验室在eLife(2017)与我们合作发布了人类的ORC结构。我们的酵母ORC结构与人类ORC结构非常相似。

此外,我们的这项研究还揭开了Cdt1的神秘面纱,Cdt1是一种负载因子,但它在加载过程中的作用一直是一个谜。我们惊讶的发现Cdt1能形成了一个三结构域结构,并且支撑三个Mcm亚基:Mcm2,Mcm4和Mcm6。有趣的是,其中一个Cdt1结构域向上,能清除与ORC-Cdc6相互作用的Mcm2-7的末端。因此我们认为Cdt1能帮助准备Mcm2-7,其准备好与ORC-Cdc6的加载。

生物通:此外,能给我们介绍一下您的研究组吗?比如主要的研究方向,近期的研究成果等等。

李教授:多年来,我都在纽约州立大学石溪分校,以及布鲁克海文国家实验室工作,去年8月我将我的实验室搬到了文安德尔研究所。我的研究重要的一环就是低温仪器,文安德尔研究所是一家私人生物医学研究机构,最近刚建立了世界级的低温冷冻电镜设施。

我们实验室致力于真核生物中的DNA复制研究,我们还与其他DNA复制生物学家合作,研究复制叉上的解旋酶功能。关于这个内容,我们最近也发表了一篇PNAS文章(2017年1月)。